Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas

Caracterización de razas de roya (Uromyces appendiculatus)

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Las condiciones climáticas de Guatemala favorecen el desarrollo y propagación de enfermedades, la información sobre la variabilidad genética de los patógenos del frijol en las áreas de Huehuetenango, Quetzaltenango, Chimaltenango y San Marcos aún es limitada. En este estudio se empleó el set de 12 variedades diferenciales, seis de origen andino y seis de origen mesoamericano, para la identificación de razas de roya, en diferentes localidades del Altiplano de Guatemala; lo cual incluyó las fases de: recolección, aislamiento, incremento, inoculación y caracterización.

Los resultados indicaron lo siguiente; los aislamientos Tot-6-S1 y Tot-7-S1 de Totonicapán fueron identificados como raza 5-47 de roya; por ello se recomiendan utilizar genes de resistencia como Ur-9, Ur-6, de origen andino. El aislamiento H-12-S1 originario de Huehuetenango resultó como raza 0-39 de roya; por lo que se pueden utilizar genes de resistencia mesoamericano como Ur-3+, o andinos como Ur-4, Ur-9, Ur-6 en la zona. El aislamiento CH-2-S1 indicó que en Chimaltenango está la raza 7-47; por lo que en la zona se puede utilizar genes de resistencia andinos como Ur-9, Ur-6. Caso similar con el resultado del aislamiento Q-1-S1 de roya de Quetzaltenango que resultó en la raza 0-47; por lo que se pueden usar genes de resistencia andinos como Ur-4, Ur-9, Ur-6.

Metodología

Para llevar a cabo la caracterización de roya del frijol, se ejecutaron las siguientes fases:

a. Muestreo, recolección y conservación:

Se tomó muestras de diferentes localidades del país en zonas productoras de frijol. Las muestras fueron colectadas siguiendo el protocolo de Steadman (2015) de la Universidad de Lincoln, Nebraska (UNL), EE. UU. Las hojas con síntomas de roya (pústulas rojizas) fueron cortadas y colocadas en sobres de papel tamaño moneda. Conservadas en un lugar con ventilación.

b. Incremento de esporas:

Se incrementaron las esporas obtenidas en cada muestra hasta contar con suficiente cantidad para la evaluación de patogenicidad en los cultivares diferenciales usando una solución de Tween-20 (0.04%). Después de ser inoculadas, las plantas se secaron a temperatura ambiente y fueron colocadas en cámara de humedad y posteriormente al invernadero.

Aproximadamente 10-14 días después se cosecharon las esporas para conservarlas en microtubos plásticos. Almacenadas a -4°C para su conservación hasta su uso.

Figura 5. Incremento de esporas de roya. Invernaderos Protección Vegetal, ICTA, Labor OvalleEvaluación de medios de cultivo para aislar.

c. Aislamiento del único Uredinium (S.I.U. en inglés):

Se eligió una sola pústula para purificar el aislamiento. Si alguna pústula presentaba diferencias de tamaño en la misma hoja sé consideró como una pústula distinta y por ende como distinto aislamiento. Las pústulas seleccionadas se inocularon por separado para su incremento, tal como se describe en la fase de incremento.

Figura 6. Proceso de aislamiento del único Uredinium. Invernaderos Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle.

d. Caracterización de razas (S.I.U. en inglés):

Para conocer la raza de los aislamientos se llevó a cabo el uso de un set estándar de 12 cultivares diferenciales de frijol. Al cual se les aplicó el el inóculo de cada Uredinium, 2.5 mg de uredinioesporas / 30ml Tween-20 (0.004). Con una concentración final de 2,0 x 104 por mL, para aplicar.

La evaluación de los tipos de infección fue basada en la escala de 1-6 que depende del diámetro de pústula, para ello se usó una lupa con escala para asegurar la veracidad de los datos. Esto se realizó 14 días después de la inoculación.

Figura 7. Toma del diámetro de las pústulas para caracterización de razas de roya. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle.

Figura 8. Diferenciales inoculadas con roya, para evaluación de caracterización de razas. Invernaderos Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle.

e. Conservación del patógeno:

Los aislamientos provenientes de un único ureidinio caracterizado, fue incrementado como se indica anteriormente. Estas esporas fueron cosechadas en microtubos, secadas con silica y conservadas a -20°C para futuros estudios.

Caracterización de razas de antracnosis (Colletotrichum lindemuthianum)

Figura 9. Síntomas de antracnosis en diferenciales inoculadas, para la caracterización de razas. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle.

La antracnosis es otra enfermedad de importancia en el cultivo del frijol ya que puede llegar a causar hasta el 100% de pérdidas de la producción. Ya que la información sobre la variabilidad genética de los patógenos del frijol es limitada en áreas como Huehuetenango, Quetzaltenango, Chimaltenango y San Marcos, se realizó este estudio para la caracterización de razas en las zonas mencionadas. En este estudio se empleó el set de 12 variedades diferenciales, seis de origen andino y seis de origen mesoamericano, para la identificación de razas de antracnosis, en diferentes localidades del Altiplano de Guatemala; lo cual incluyó las fases de: recolección, aislamiento, incremento, inoculación y caracterización.

De acuerdo a los resultados de la investigación, el aislamiento H-2-S1 de Cantón Las Regadillas Chiantla, Huehuetenango y H-3-S1 de Pino Chiantla Huehuetenango se identificaron como raza 9. Ésta raza no ha sido previamente reportada en Guatemala y afecta los genes Co-11 y Co-2, ambos de origen Mesoamericano. Por lo que se recomienda usar los genes de resistencia Co-1, Co-13, Co-15, Co-12, Co-3, Co-33, Co-43, Co-4, Co-5, Co-6, Co-8, Co-42, Co-35 y Co-52.

Los aislamientos Q-5-S3 y CH-1-S1 provenientes de Quetzaltenango y Chimaltenango respectivamente se identificaron como raza 584. Los mismos afectaron los genes Co-2, Co-3, y Co-5 de origen Mesoamericano, por lo que se recomienda utilizar los genes de resistencia Co-11, Co-1, Co-13, Co-15, Co-12, Co-33, Co-43, Co-4, Co-6, Co-8, Co-42, Co-35, Co-52.

Metodología

a. Muestreo, recolección y conservación:

La recolección se realizó en los departamentos de Quetzaltenango, Huehuetenango, San Marcos los cuales eran los departamentos planificados. Sin embargo, dado a las condiciones favorables para el patógeno y la presencia de síntomas se incluyeron muestras de Totonicapán y Chimaltenango. En total se obtuvo un banco de 52 muestras que conforman 30 localidades diferentes, de las cuales, se aislaron y caracterizaron cuatro muestras. Las muestras se conservaron en sobres de papel individuales, en una caja con sílica gel.

b. Incremento de esporas:

b.1. Fase de purificación de C. lindemuthianum

En la fase de purificación se realizaron diferentes medios, para obtener el inóculo requerido como el agar-agar, y PDA.

b.2. Siembra en medios de cultivo

Se cortaron explantes de 5x3mm de vainas y hojas infectadas, desinfectados en una solución de agua y cloro al 5% por cinco minutos, los cuales se dejaron secar.

Posterior a este proceso se colocaron entre 3 a 5 explantes por caja (PDA o Agar-agua) y se dejaron en la incubadora a 20°C por 10 días. En los platos donde el micelio se estaba desarrollando, pero tenía contaminación se realizaron pequeños cortes del micelio para transferirlos a nuevas cajas Petri.

Figura 10. Siembra de explantes para aislamiento de antracnosis. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.

b.3. Purificación

Al término de los 10 días en la incubadora, se trasladó micelio e hifas del hongo al medio Mathur´s, el cual hace esporular las hifas mientras siguen creciendo. Se usó una aguja de transferencia estéril y flameada.

En un rango de 2 a 5 días se pudo observar el crecimiento de esporas. El cultivo monospórico entre 10- 12 días cubrió totalmente el medio visualizándose las estructuras del hongo.

Figura 11. Cultivo monospórico de antracnosis. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.

b.4. Incremento:

Un aislamiento monospórico permitió realizar varios incrementos. El cual se realizó con solución de esporas, también con transferencia de esporas a hojas o vainas de frijol esterilizadas ambas sobre medio Mathur´s.

Figura 12. Cajas petri y tubos de ensayo, para incremento de esporas. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.

Figura 13. Incremento de esporas y aislamiento monospórico de antracnosis, purificado. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.

c. Caracterización de Colletotrichum lindemuthianum:

Para la inoculación de los sets de diferenciales se seleccionó una caja petri con incremento. La concentración final recomendada para C. Lindemuthianum es de 1.2 x 106 conidias/ml.

Figura 14. Conteo de esporas de antracnosis en cámara Neubauer®. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.

Posterior a la inoculación se dejaron en la cámara de humedad con un +75% H, por tres días, luego se pasó a invernadero y en 14 días se realizó la toma de datos. En el caso de antracnosis, se midió el tipo de infección en planta basado en la escala de 1-9 CIAT.

Figura 13. Incremento de esporas y aislamiento monospórico de antracnosis, purificado. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.

d. Conservación de Colletotrichum lindemuthianum:

Para conservar aislamientos que puedan ser requeridos en el futuro se utilizó sílica gel y refrigeración de papel Whatman® con el patógeno.

Figura 16. Silica gel (4°C). Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.

Figura 17. Papel infectado (-20°C). Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.