Protocolo de aislamiento de Phytophthora infestans
El propósito de esta investigación por el momento, es establecer un protocolo por medio de métodos convencionales adaptados al laboratorio de aislamiento e identificación de diferentes cepas de Phytophtora infestans. Determinando aspectos generales del género para un buen análisis de las muestras aisladas. Esta información será utilizada para futuros investigadores que trabajen con enfermedades causadas por este oomicete. Las claves convencionales contribuyen a determinar los síntomas y signos del patógeno presentes en plantas enfermas.
Figura Hoja con síntomas de P. infestans.
Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle
Figura Aislamiento de P. infestans. en medio de cultivo
Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle.
Figura Aislamiento puro in vitro de P. infestans.
Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle.
Diagnostico serológico y molecular anual de plántulas in vitro destinadas a la producción de
semilla de hortalizas.
Para el desarrollo de un buen método de producción de semilla en el Instituto de Ciencia
y Tecnología Agrícolas, se produce semilla certificada de papa por medio de tres etapas: cultivo de meristemo in vitro solo o combinado con termoterapia para la eliminación de virus (PVX, PVY, PLRV, PVS).
Al contar con un lote de 50 plantas por cultivar se procede a utilizar la prueba serológica, ensayo inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar los 4 virus presentes en el área del occidente de Guatemala.
El objetivo es seleccionar las plantas que no presenten virus, las cuales serán
incrementadas por cultivo in vitro para la producción de semilla en invernadero.
Cuando las plantas tienen 60 días de establecidas en invernadero y campo se procede nuevamente
a realizar la prueba Elisa para determinar el nivel de presencia viral en la plantación y sanear las plantas con presencia de los cuatro virus.
La prueba serológica ELISA, es una técnica de inmunoensayo en el cual un antígeno inmovilizado
se detecta mediante un antígeno en lazado a una enzima (peroxidasa o fosfatasa), capaz de generar un cambio de color (amarillo) que es cuantificable mediante espectrofotómetro, siendo una prueba sensible y con
gran especificidad, permitiendo tener resultados en poco tiempo.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio se utiliza para determinar si la planta
tiene o no presencia viral. Los kit comerciales vienen con su testigo positivo y negativo.
Figura Resultados de DAS ELISA, para el virus PVY, en muestras de cultivares de papa provenientes de campo. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle.
Diagnostico en yuca
Las enfermedades virales en el cultivo de yuca son un problema que se ha subestimado en
nuestro medio y el Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas en los últimos años se ha enfocado en producir semilla de yuca para la seguridad alimentaria en Guatemala.
El ICTA a su vez ha liberado cultivares de yuca que cuentan con buen potencial de producción,
pero con poca información sobre la sanidad vegetal principalmente referente a virus. Como apoyo al programa de hortalizas, el laboratorio de protección vegetal puede mediante el análisis de ELISA se detectan los
virus: mosaico de las nervaduras (CsVMV), mosaico común (CsCMV), y el virus x de la yuca (CsXV).
También existen virus que no se pueden detectar por ELISA, debido a que no presentan síntomas en
las platas las mismas deben injertarse para observar los síntomas, o utilizar pruebas de diagnóstico molecular con virus asociados al cuero de sapo en yuca.
El diagnostico se basa en la reacción de la Cadena de Polymerasa en Trascriptasa Reversa
(RT-PCR), cosiste en sintetizar cDNA por medio de un retotrascriptasa o transcriptasa reversa, seguida de una amplificación por medio de PCR. Para utilizar esta técnica se siguen diferentes etapas: extracción de ARN
de cadena doble (dsRNA), síntesis de DNA complementario (cDNA) y por último RT-PCR.
Figura Proceso de extracción de ARN en yuca. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.
Figura Maceración de muestras de yuca colectadas en campo. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.
Figura Pallet de ARN de muestras de yuca. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.
Figura Gel de agarosa al 2% con muestras de ARN de materiales de yuca. Protección Vegetal, ICTA, Labor Ovalle Quetzaltenango.
Referencias:
- Calvert, L., Cuervo, M., Ospina, M., Fauquet, C., y Ramírez, C. (1996). Characterization of cassava common mosaic virus and a detective RNA species. Journal of General Virology, (77), 525-530.
- Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas ICTA. (2002). Recomendaciones Técnicas Agropecuarias para la Región VI, Guatemala.
- Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas ICTA, 2002. Recomendaciones Técnicas Agropecuarias para
la Región VI, Guatemala.
- Ministerio de Agricultura Ganadería y Alimentación. (2011).
- Velasco, A., Pineda, B., y Nolt, B. (1985). Prueba inmunoenzimática (ELISA) para la detección de virus. Programa de virología de yuca CIAT, Cali, Colombia, 4p.
